Modifié CRISPR dans les neurones permet aux scientifiques de nouveau pouvoir de sonder les maladies du cerveau

Une équipe de chercheurs de l’UC San Francisco et les Instituts Nationaux de la Santé ont réalisé une autre CRISPR première, celle qui peut changer fondamentalement la façon dont les scientifiques de l’étude des maladies du cerveau.



Dans un article publié le 15 août dans la revue Neuron, les chercheurs décrivent une technique qui utilise une version spéciale de CRISPR développé à UCSF systématiquement modifier l’activité des gènes dans les neurones humains générés à partir de cellules souches, la première réussite de la fusion de cellules souches dérivées de types de cellules et de CRISPR technologies de dépistage.


Bien que les mutations et les autres variantes génétiques sont connus pour être associés à une augmentation du risque pour de nombreuses maladies neurologiques, des goulots d’étranglement technologiques ont contrecarré les efforts des scientifiques travaillant pour comprendre exactement comment ces gènes qui causent la maladie.


“Avant cette étude, il y avait des limites importantes qui limitent ce que les scientifiques pourraient faire avec les neurones humains dans le laboratoire,” a déclaré Martin Kampmann, PhD, professeur associé à l’UCSF de l’Institut pour les Maladies Neurodégénératives, un CZ Biohub Chercheur et co-auteur principal de la nouvelle étude.


Pour une chose, jusqu’à assez récemment, il n’y avait aucun moyen pour les scientifiques de manière fiable obtenir de l’homme les cellules du cerveau qui pourraient être utilisés dans l’avancée des expériences de laboratoire, a expliqué Kampmann, également membre de l’UCSF Weill Institut des Neurosciences. “Il a été possible d’obtenir les neurones donnés par les patients qui avaient subi des procédures qui impliquent la suppression de tissus du cerveau pour traiter l’épilepsie ou d’un cancer du cerveau. Mais ces échantillons ne peuvent survivre pendant quelques jours. Vous ne pouvez pas effectuer des expériences pour la sonde de la fonction des gènes à court terme des neurones.”


Au lieu de cela, les scientifiques s’appuient généralement sur des modèles animaux de la maladie du cerveau, ce qui peut ne parviennent pas à capturer de nombreuses nuances de neurobiologie humaine.


Une percée est venue en 2006, lorsque Shinya Yamanaka, MD, PhD, de l’Université de Kyoto et l’UCSF affiliés à Gladstone Institutes, a découvert un moyen de rembobiner le développement de l’horloge et de transformer des cellules adultes en cellules souches, qui pourraient, avec quelques remontrances, être transformé en n’importe quel type de cellule dans le corps-y compris les neurones. Ces “cellules souches pluripotentes induites” (cspi) a fait de l’homme les cellules du cerveau largement disponibles pour la recherche en laboratoire.


Lorsque les CRISPR gène-système de montage est arrivé six ans plus tard, les scientifiques pensaient qu’enfin ils avaient tous les outils dont ils auraient besoin pour manipuler les gènes dans les neurones humains et de déterminer comment ils contribuent à une maladie neurologique.


Mais les scientifiques ont rapidement découvert que l’ADN-machines de découpe de la CRISPR système, une enzyme connue sous le nom Cas9, ne se mélangent pas bien avec de la cspi. “Les cellules souches ont une très actif en réponse aux dommages de l’ADN. Lorsque Cas9 produit même un ou deux ADN coupes, il peut conduire à une toxicité qui provoque la mort des cellules,” Kampmann a dit.


Donc Kampmann décidé de s’attaquer au problème de toxicité. Comme un post-doctorat dans le laboratoire de l’UCSF le Professeur Jonathan Weissman, PhD, Kampmann a co-inventé un outil appelé CRISPRi (pour les “interférences”), une forme modifiée de CRISPR la technologie dans laquelle le Cas9 enzyme a été désactivé. Lorsque CRISPRi trouve le gène, il cherche, il supprime son activité sans faire des coupures. En conséquence, contrairement à la norme de CRISPR-Cas9, Kampmann prédit, CRISPRi ne devrait pas être toxique pour les cspi ou de cellules souches dérivées de neurones.


Dans le nouveau document, Kampmann et ses collaborateurs décrivent comment ils se sont adaptés CRISPRi pour une utilisation dans les cspi humaines et iPSC dérivé de neurones, et constaté qu’il pouvait cibler et interfèrent avec les gènes sans tuer la cellule-un exploit qui a longtemps échappé aux scientifiques.


Grâce à ce système, les chercheurs ont démontré comment la technique peut être utilisée pour trouver des gènes qui peuvent causer ou contribuer à des maladies du cerveau. Par exemple, ils ont identifié des gènes spécifiquement prolonger la durée de vie de neurones, mais n’ont aucun effet comparable sur la cisp ou les cellules cancéreuses. Ils ont également trouvé des gènes qui augmentent le nombre de neurites — projections qui se développent à partir de neurones qui transmettent l’influx nerveux-et déterminé à quelle fréquence ils ramifiée.


Mais l’un des plus surprenants résultats a été la découverte que “le ménage” gènes, connus pour être essentiels pour la survie, mais la pensée de la même fonction dans toutes les cellules — en fait, se comportent différemment dans les neurones et les cellules souches. Lorsque les chercheurs ont interféré avec les mêmes gènes de ménage dans ces deux types cellulaires, les cellules ont répondu par l’activation (ou de la désactivation) d’un très différente d’un ensemble de gènes. Ce résultat suggère que, contrairement aux idées reçues, les gènes de ménage peut ne pas fonctionner de la même manière dans les différents types de cellules, une idée qui Kampmann et son laboratoire sont désireux d’explorer plus loin, car ces différences peuvent jouer un rôle important dans la maladie.


Kampmann est maintenant à l’aide de la technologie à l’étude de différents types de neurones dans un effort pour déterminer pourquoi certaines maladies de manière sélective affecter seulement un sous-ensemble de neurones, tels que la façon dont les neurones moteurs sont sélectivement endommagé dans la SLA. Il est également l’expansion de ses enquêtes dans d’autres types de cellules du cerveau — y compris les cellules appelées astrocytes et la microglie — les scientifiques récemment découvert comment produire de cspi humaines.


Mais en fin de compte, le but est de transformer cette technologie qui combine CRISPRi et cspi en un outil qui révèle bien besoin de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement des maladies du cerveau.


“Un des grands défis auxquels le secteur est confronté, c’est que, pour la plupart de ces troubles, la précision des voies moléculaires que nous devrions cible pour le développement de médicaments restent floues”, a déclaré Michael Ward, MD, PhD, co-auteur principal de la nouvelle étude et d’un médecin-chercheur à l’institut National de la Santé.


“Avec cette technologie, nous pouvons prendre de la peau ou de sang à partir de cellules d’un patient avec une maladie neurodégénérative comme la maladie d’Alzheimer, de les transformer en neurones ou d’autres cellules du cerveau et de trouver des gènes de contrôle des défauts cellulaires associés à la maladie,” a dit Kampmann. “L’information peut nous permettre de déterminer les meilleures cibles thérapeutiques.”


Financement: L’étude a été soutenue par le Programme de Recherche Intra-muros de la NIH/NINDS, un NIH Directeur du New Innovator Award (NIH/NIGMS DP2 GM119139), NIH/NIA subventions (R01 AG062359 et R56 AG057528), le NINDS Tau Centre Sans Murs (NIH/NINDS U54 NS100717), Allen Distingue Investigator Award de la Paul G. Allen Family Foundation, un Chan-Zuckerberg Biohub Investigator Award, et un Tau Consortium Prix de Chercheur.


Informations à fournir: Martin Kampmann a déposé une demande de brevet liées à CRISPRi et CRISPRa de dépistage du PCT (PCT/US15/40449) et siège au Conseil Consultatif Scientifique de Moteur de Biosciences.